可将多种癌细胞系、患者恶性血细胞或实体癌活检标本移植到nsg小鼠模型中（图 1A）nsg，对CART细胞疗法的疗效、安全性、持久性、衰竭、毒性和免疫反应进行临床前评估nsg，其中此处通过多个示例进行nsg了说明（图1B）。
图 1. CAR T细胞疗法在人源化癌症小鼠模型中的临床前建模。
(A) 用于不同恶性肿瘤临床前建模的不同人源化小鼠模型。(B) 为 (A) 中的适应症获得的CAR T细胞治疗的相关临床前数据。
1.1 CAR T或NK细胞在人源化小鼠中的安全性和毒性评价
CAR T/NK细胞疗法的安全性是一个重要问题。尤其是在离体转导和扩增过程中，CD19-CAR不必要的转移到一个单一的白血病细胞中，导致 B 细胞恶性肿瘤患者复发和死亡[66]。此外，正如已经报道的那样，CAR T 细胞疗法的一个严重毒副作用是细胞因子释放综合征和/或肿瘤外/靶标毒性[34]。
因此，刘等人[67] 在CAR NK细胞中建立了安全措施。有趣的是，他们使用配备有抗CD19 CAR、IL-15 表达盒和诱导型caspase-9自杀基因[68]的脐带血NK细胞，以便在发生不良事件时清除CAR NK细胞.IL-15有助于保存干细胞记忆 T 细胞表型。值得注意的是，这些CAR NK细胞释放的IL-15显着改善了它们在Raji B细胞淋巴瘤异种移植模型中的抗肿瘤功能、增殖和持久性[67]。在同一个小鼠模型中，这些作者证明，在CAR NK毒性的情况下，他们能够通过注射一个小的二聚化分子来激活自杀基因，从而在体内诱导快速有效地消除CAR NK细胞 [67]。这些源自脐带血的抗CD19 CAR NK细胞具有内置安全开关，目前正在临床试验中进行评估(NCT03690310)。
GD2是神经母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌和肉瘤等多种实体癌表面表达的神经节苷脂抗原[69,70]。一些使用GD2定向CART细胞治疗神经母细胞瘤的临床试验非常成功，显示出CAR T细胞的长期持续性[71,72]。然而，GD2也在健康神经元、黑色素细胞和神经纤维上表达[69,73]。因此，有人担心CAR T细胞介导的神经破坏可能会导致中枢神经系统毒性。里奇曼等人[74]为了增加抗GD2 CAR T细胞的功效，将单点突变引入到抗GD2 scFv中。这种新的GD2-CAR设计在NSG小鼠中对人神经母细胞瘤异种移植物显示出增强的抗肿瘤活性。然而，那些肿瘤减少率较高的小鼠经历了严重的脑毒性[74]。在这种与神经元破坏相关的人源化癌症小鼠模型的大脑中发现了CAR T细胞的强烈浸润。这些结果发出了一个严重警告，即在基本的正常健康细胞上表达的癌症抗原是有问题的，需要仔细关注。CAR设计中的修改，即使是很小的修改，也可能会引起安全问题。尽管其他抗 GD2 CAR设计 [75] 没有在神经母细胞瘤的其他异种移植模型中再次报告脑毒性，但需要谨慎，仔细的临床前评估可能会在进入 GD2-CAR T临床试验之前揭示毒性。毋庸置疑，针对神经母细胞瘤的 I 期 CAR T 试验侧重于治疗的安全性 (NCT02107963)。如上所述，对于抗 CD19 CAR NK细胞，建议引入自杀基因以消除 GD2-CAR T，以防出现严重的毒副作用。
1.2.新型“优化”CAR 设计在人源化小鼠中的功效
目前，尚不完全清楚为什么有些CART细胞会在患者体内持续存在、表型变化、衰竭、肿瘤靶向性差、免疫、体内脱靶毒性都可能影响CAR T细胞治疗的结果。为了使新的CAR T 细胞设计及其生产合理化，在体内追踪这些细胞的方法将提供有关治疗患者毒性和药效学的宝贵信息。此外，这可能会加速同种异体环境中CAR T细胞疗法的转化。
Cassucci 及其同事[76]为促进分离和随访患者体内CAR T细胞的持久性，在CAR自身内加入了一个基于低亲和力神经生长因子受体 (NGFR) 的细胞外间隔物，缺乏其细胞内信号结构域 [77,78]。首先，这允许通过简单的抗NGFR磁珠选择来丰富CAR+ T细胞。其次，针对 CD44 变体6的 NGFR 间隔的CAR T细胞允许在注入临床相关（THP-1 荧光素酶+ 或 MM.1S-荧光素酶+）异种移植NSG小鼠后，通过流式细胞术分析使用抗- NGFR 抗体。这允许在NSG异种移植物中追踪 CAR T 细胞如何扩增、持续并诱导对白血病和骨髓瘤的强大抗肿瘤活性[76]。作为一项安全特性，这些作者还在 CAR 构建体中加入了一个自杀基因（胸苷激酶），以在发生不良事件时消除 CAR T 细胞，例如在发生 GvHD 时的同种异体环境中[79]。事实上，在 NSG 异种移植小鼠中使用药物更昔洛韦有效地消除了 CAR T 细胞。由于CD44v6在急性髓系白血病和多发性骨髓瘤中过度表达 [80,81]，含有 NGFR 间隔区的CD44v6 CAR T细胞配备了自杀基因，最近进入了针对这些适应症的临床试验(NCT04097301)。
有趣的是，Weist 等人[82]通过在注入两种异种移植肿瘤模型之前用 89Zr-oxine [83,84] 标记 CAR T 细胞来解决同样的问题nsg：1）胶质母细胞瘤，其中他们使用 89Zr-oxine 标记的CAR T细胞靶向存在的IL13Rα2 表位2) 皮下前列腺肿瘤NSG模型，在该模型中，他们注射了前列腺干细胞抗原靶向CAR T细胞 [82]。正电子发射断层扫描 (PET) 成像允许高灵敏度地根据 CAR T 细胞的给药途径以定量方式跟踪体内 CAR T 细胞的肿瘤趋向性和分布。
布朗等人[85]，确实表明 IL13Rα2 靶向 CAR T细胞提高了对胶质母细胞瘤的抗肿瘤功效，尤其是在局部颅内递送时。因此，CAR T细胞追踪可能清楚地预测CAR T细胞设计和给药途径对临床应用的体内性能的影响。
为了将失去CD19表达的白血病细胞抗原逃逸的风险降至最低，设计了一种双特异性 CAR，靶向两种B细胞特异性分子CD19和CD20。与仅靶向CD19+白血病细胞的CD19-CART 细胞相比，双特异性CD19/CD20-CAR T细胞也能根除所有白血病细胞，即使是那些在异种移植NSG模型中表面失去CD19表达的细胞[86]。有趣的是，通过将携带代表 B-CLL突变景观的个体KO的 B 细胞系注射到小鼠体内，在 B-CLL 异种移植小鼠模型中评估了抗 CD19 CAR T细胞疗法 [87]。在体内，他们证实抗CD19 CAR T细胞延长了不同遗传类型B-CLL肿瘤细胞的存活期，并根据引入的突变显示出不同的抗肿瘤功效[87]。这强调了在 B-CLL治疗中需要更加个性化和优化的CAR设计。
1.3 CAR T和NK细胞在体内的持久性和耗竭
CAR T细胞通常由 PBMC 产生，并在 IL-2 存在下通过培养进行扩增 [88]。然而，这意味着扩增后的自体 T 细胞在表型上是异质的，主要由高度分化的 T 细胞组成nsg：效应记忆 (Tem) 或效应 T 细胞 (Teff)，它们容易耗尽并且不容易在体内持续存在。相比之下，当分化程度较低的幼稚或干细胞记忆 T 细胞 (Tscm) 被设计用于 CAR表达时，它们会比前面提到的 T 细胞亚群诱导更有效的抗肿瘤反应[89,90,91]。IL-7 和 IL-15 培养物或 IL-15 由 CAR T 细胞本身表达，似乎可以保留表达 CAR 的 Tscm 细胞[92,93]。因此，alizadeh 等人[94]的目标是通过在IL-15存在的情况下扩增CAR T细胞来生产消耗较少且分化较少的 CAR T细胞。这些作者证实了与IL-2相比，在IL-15存在下Tscm CAR T细胞的保存。此外，他们在IL-15和IL-2中扩增了抗CD19CAR T细胞，并将它们施用于异种移植荧光素酶标记的Raji B细胞系的NSG小鼠。在该模型中，IL-15扩增的CART细胞在抗肿瘤效力和体内持久性方面的表现远远优于IL-2中扩增的细胞[94]。有趣的是，这可能是因为IL-15扩增的 CAR T细胞下调了它们的mTORC活性，导致CAR T细胞从糖酵解到线粒体呼吸的代谢转换，这是持久记忆 T细胞的标志[14,15] ,94]。此外，这种IL-15效应与CAR设计（共刺激域 CD28 或4-1BB）和CAR T细胞靶标（用于 B 细胞靶向的抗 CD19 CAR 或用于胶质母细胞瘤的抗 IL-13Ra2-CAR）无关。这为改进未来的 CAR T 细胞疗法开辟了可能性。
Heczay及其同事 [95] 选择了另一个用于CAR表达的T细胞亚群，即CD1d限制性自然杀伤 T (NKT) 细胞。它们具有内在的抗肿瘤特性，并且CD1d仅在少数细胞类型上表达，从而限制了自体或同种异体环境中的潜在毒性 (GvHD)[96]。这些作者为 NKT 细胞配备了针对GD2神经节苷脂的CAR，在神经母细胞瘤中高度表达 [71]。特别是具有CD28和4-1BB共刺激结构域的第三代GD2CAR设计增强了这些NKT CAR细胞的体内持久性，并在转移性神经母细胞瘤的异种移植NSG模型（包括人类血液系统）中显示出有效的抗肿瘤活性。该模型与在患者中检测到的非常相似，因为NB肿瘤的生长/维持需要造血系统。重复施用 NKT CAR 细胞，由于排斥而无法使用CAR T细胞，可在不诱导GvHD的情况下增加该小鼠模型的存活率。
在某些特定应用中，与体内持续表达相比，人们可能更喜欢瞬时CAR表达。外周 T 细胞淋巴瘤(PTCL) 没有有效的治疗选择，结果也很差，最近成为CAR T细胞治疗的目标疾病。最近对不同PTCL和许多正在评估的新药所涉及的机制的概述强调了找到有效的靶向治疗的难度[97,98]。因此，通过抗 CD4 CAR T细胞疗法靶向这些 T 细胞淋巴瘤中的恶性CD4+ T 细胞被认为是一种选择 [99]。工程抗 CD4 CAR CD8+ T细胞在移植了KARPAS 299侵袭性 PTCL 细胞系的异种移植NSG小鼠体内显示出显着的抗白血病作用。然而，由于抗CD4 CAR T 细胞可以持续数月或数年，患者可能会由于严重的副作用而遭受免疫缺陷：长期消除不仅恶性而且健康的 CD4+ T细胞。在这一特定应用中，人们可能更喜欢瞬时CAR表达而不是体内持续表达。
由于与CAR T细胞相比，CAR NK细胞的寿命有限，周转时间约为2周[44]，因此它们可能是PTCL中抗CD4 CAR治疗的首选靶细胞。预计这些CAR NK细胞在清除癌细胞后不久就会消失，因此长期毒性风险较低。平兹等人证明抗CD4 CAR NK细胞通过溶解肿瘤细胞显着延长了PTCL异种移植小鼠的存活[99]。这为没有或几乎没有治疗选择的 PTCL 患者开辟了一条新的治疗方法。由于CD4在急性髓性白血病细胞 (AML) 上高水平表达，Salman等人[58]在注射了表达荧光素酶的MOLM-13白血病细胞的NSG小鼠中评估了抗CD4 CAR NK细胞。这些抗CD4 CAR NK在第9天显示出98%的肿瘤消退，与未经修饰的NK 治疗的小鼠相比，这更有效[58]。
陈等人[26]通过靶向CD5（一种在大多数 T 细胞恶性肿瘤（包括 T-ALL 和 T 细胞淋巴瘤）表面表达的标记物）采用了类似的方法 [100,101]。抗 CD5 CAR NK 细胞抑制和控制 T-ALL 异种移植小鼠模型中的癌症进展，但未能根除已建立的肿瘤细胞 [26]。此外，CAR NK 细胞没有持续存在，因为它们在注射后 30 天没有被检测到，再次强调 CAR NK 细胞表达是短暂的。或者，如 Mamonkin 等人报道的抗 CD5 CAR T 和 NK 细胞。[27] 还允许在 T-ALL 异种移植模型中抑制疾病进展。
马乔西亚等人[102] 在靶向恶性 T 细胞时，选择另一种策略来避免 T 细胞淋巴瘤中CAR T细胞诱导的免疫缺陷。由于 TCR-αβ 在 T 细胞癌中高度表达[103]，他们建议将CAR T细胞靶向由TRBC1或TRBC2以互斥方式编码的两个现有TCR β链恒定区之一[104,105]。因此，通常是单克隆的 T 细胞淋巴瘤细胞将表达 TRBC1或TRBC2。他们决定在恶性T 细胞均质表达TRBC1的模型中将CAR T细胞靶向 TRBC1。注射了TRBC1+ Jurkat细胞和TRBC2+ JKO细胞的NSG小鼠，当用TRBC1导向的 CAR T 细胞处理时，显示出 Jurkat 细胞完全消除，而 JKO T 细胞是唯一幸存的 T 细胞。此外，将人类 PBMC 与NSG 中的TRBC1+ Jurkat 细胞共同注射，然后注射TRBC1 CAR T 细胞导致人类非 CAR T 细胞存活，证实了Jurkat消除过程中健康 T 细胞的持续存在 [102]。由于只有三分之一的健康T细胞表达TRBC1，因此在临床中消除这些健康 T 细胞不会导致严重的免疫抑制。
通常，CAR T 细胞表达的靶细胞是成熟的T或NK细胞。为了使CAR T细胞持久存在，一些作者在造血干细胞水平上引入了CAR [106]，因为这会导致 CAR 修饰的T细胞的持续输出和抗癌免疫的长期持久性。拉森等人[107] 将抗CD19 CAR引入HSC。将CAR修饰的 HSC 移植到新生的NSG小鼠中，从而可以检测这些人源化小鼠血液中抗CD19-CAR T细胞的体内输出。此外，随后注射恶性Raji B细胞表明，与未转导的HSC受体小鼠相比，移植了抗CD19 CAR转导的HSC的NSG小鼠即使在120天后也没有发生肿瘤，后者发生了巨大的肿瘤并且没有存活超过60天 [107]。
1.4 在体内避免针对 CAR T 细胞的免疫反应
重要的是，早期 CAR 含有鼠抗原结构域，这可能会诱发患者的免疫反应，导致 CAR T 细胞过早清除，并可能导致肿瘤复发[8,108,109]。为了克服这个问题，一个团队开发了一种完全人类CD19特异性的CAR，它被证明可以在NSG小鼠中消除人类淋巴瘤异种移植物 [110]。阿拉班萨等人[111] 通过插入人类CD8的铰链和跨膜结构域 (TM)，进一步将抗CD19 CAR 人性化，从而改进了这种设计。在异种移植小鼠模型中，与 CD28 TM 结构域相比，该 TM 导致更弱的T细胞活化和更低的细胞因子释放[111]。最近使用这种优化CAR的临床试验证实了这些结果，并得出结论，CAR中包含的铰链和TM结构域决定了CART细胞释放的细胞因子水平[112]。
布鲁姆等人开发了一种针对B细胞成熟抗原 (BCMA) 的人源化CAR [113]。BCMA-CAR T 细胞根除多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤异种移植模型中的肿瘤细胞[113]。在另一项研究中，BCMA CAR T细胞还能够靶向人源化NSG小鼠中的其他B细胞恶性肿瘤[114]。很明显，与基于鼠的CAR相比，完全人源化的CAR可以减少免疫排斥。为了进一步降低免疫反应，Lam及其同事开发了一种抗BCMA CAR，仅携带一个完整的人重链可变域而不是完整的 scFv [115]。NSG小鼠被移植了MM.1S 多发性骨髓瘤细胞系或人类骨髓瘤细胞系。在建立实体瘤后，注射抗BCMA CART细胞证实肿瘤完全消除。有趣的是，只有当仅包含抗BCMA scFv重链CAR与4-1BB共刺激结构域结合时，才能在体内发现CAR T细胞的长期持久性和更高的扩增，而当包含 CD28 co -刺激域[115]。相同的策略适用于抗CD33 CAR，用于治疗表达高水平 CD33 抗原的急性髓性白血病 (AML) 细胞 [116]。
CAR T细胞疗法在体内遇到多种障碍，例如来自肿瘤及其微环境的抑制信号。后者可以表达抑制性配体，即PD-1的程序性死亡配体 1 (PDL-1) 和 2 (PDL-2)，其可以在活化的 CAR T细胞[117]或NK细胞上上调。这种PDL-1/PDL-2与PD-1 h的结合会抑制这些基因修饰细胞的功能并降低其持久性[118,119,120,121,122,123,124]。为了克服这个特殊问题，已经开发了CAR T和NK细胞，其中去除了抑制性受体 [125,126,127,128,129,130] 或表达共刺激信号或分泌因子，可以重新激活免疫系统，如抑制剂或细胞因子 [131,132]。其中一种免疫刺激细胞因子是IL-12P70，据报道它可以增加 CAR T 细胞活性 [133,134,135]。Sachdeva 等人[136] 通过对CAR T细胞进行基因编辑，他们使用一种优雅的策略同时实现了两个目标，其中他们将IL-12P70表达置于编码PD1的PDCD1基因座中。这意味着IL-12P70的分泌受PDCD1调控元件的控制，因此只有在CAR T细胞遇到肿瘤抗原时才会表达。此外，这同时导致CAR T细胞上 PD1表达的消除，CART细胞是T细胞功能的一个主要检查点。在异种移植荧光素酶+Raji细胞的NSG小鼠中，这些作者证明，与单独使用PDCD1 或 CAR T 的 CAR T细胞KO相比，用于PDCD1的分泌IL-12的CAR T细胞敲除 (KO) 显着增加了抗肿瘤活性和 CAR T 细胞积累细胞对应物[136]。这些结果可以通过受控的IL-12P70分泌来解释[133,134,135,137]。
1.5 CAR T细胞联合疗法评价
最近Parihar等人[138] 报道了一种有趣的组合方法来提高CAR T细胞对实体瘤的活性。他们决定结合CAR NK和CAR T细胞疗法。NK细胞强烈表达 NKG2D [139]，一种细胞毒性受体，其配体在几种实体瘤和肿瘤浸润性髓源性抑制细胞(MDSC) 上过表达[140]。配体与 NKG2受体的结合降低了NK的抗肿瘤活性。作者[138]表明表达针对NKG2D受体的 CAR [141]的NK细胞能够消除肿瘤中的抑制性骨髓细胞，并以这种方式抵消免疫抑制，使肿瘤特异性CAR T细胞持续存在并发挥作用在肿瘤微环境中。他们使用了神经母细胞瘤的异种移植模型，通过将LAN-1肿瘤细胞与人MDSC细胞共同皮下注射到NSG小鼠中，重建了肿瘤微环境。然后用NKG2D定向的NK和GD2（靶向神经母细胞瘤）定向的CART细胞处理这些细胞。体内MDSC细胞被CAR NK细胞从肿瘤中清除，并且与单独的CAR T细胞输注相比，CAR T细胞向实体瘤的募集增加，并且肿瘤消退。这些数据可能会支持针对实体瘤的免疫疗法组合。这只是CAR T细胞疗法组合方法的一个例子，但在NSG异种移植模型中测试了多种方法[142,143,144]。
1.6 CAR T细胞作用机制
CAR T细胞疗法疗效的一个主要障碍是 T 细胞耗竭，其特征是抑制性受体的表达以及转录和表观遗传改变[145,146,147]。但 CAR T 细胞耗竭和功能障碍的机制直到最近还不清楚。因此，林恩等人[148] 研究了这个重要的问题，使用一个强直信号 CAR，驱动健康的 CAR T 细胞耗尽 [12]。在这些衰竭的 T 细胞中，检测到激活蛋白 1 (AP-1) 转录因子结合基序的失调以及碱性亮氨酸拉链 (bZIP) 和干扰素调节因子 (IRF) 的表达增加。重要的是，这些基因与衰竭基因特征的调节有关。林恩等人[148]假设衰竭可能是由于缺乏c-jun/c-Fos/AP-1 异二聚体。值得注意的是，过表达c-jun的CAR T细胞变得对衰竭有抵抗力，并且在遇到抗原时，它们显示出更高的IL-2 和 IFNγ 产量，以及增加的干细胞记忆和中枢记忆表型水平，这是长期持续存在的T细胞的特征。
此外，使用Nalm6-GD2+白血病异种移植NSG模型，即使在癌细胞上的抗原表达较低时，c-jun 过表达的 CAR T 细胞也具有优异的抗肿瘤活性。重要的是，表达c-jun的CAR T细胞在实体瘤中表现出增强的抗肿瘤功能。例如，与对照对应物Her2 CAR T细胞相比，c-jun+Her2靶向CAR T细胞在体内143B骨肉瘤肿瘤生长的存活率提高，并且这些CAR T细胞在体内的扩增能力更强。此外，对浸润性 c-jun+Her2 CAR T细胞的单细胞分析表明，它们具有强烈的增殖、活化和耗竭标志物的下调。总之，在 CAR T细胞中过表达 c-Jun 避免了表型和功能 T细胞耗竭，因此在几种临床前异种移植小鼠模型中增加了抗肿瘤控制，这鼓励了未来 Jun+CAR T细胞的临床测试。但是，在考虑进入临床之前，仍然需要进行安全性测试（脱靶效应）。
基于异种移植NSG的肿瘤模型也有助于揭示为什么CAR T细胞疗法会通过肿瘤抗原丢失或 CAR 靶向抗原的表达降低而在临床中诱导肿瘤复发[112,149,150,151,152,153]。哈米赫等人[153] 使用了NALM6 B 细胞急性淋巴细胞白血病异种移植模型（ALL），他们在其中注入了低剂量的抗CD19 CAR T细胞，导致肿瘤复发。NALM6细胞的体内 CD19 表达显着降低，而令人惊讶的是，一小部分CAR T细胞对CD19染色呈阳性。这些作者透露，这是由于靶抗原 (CD19) 从B细胞转移到T细胞的一个活跃过程，这种机制称为吞噬作用 [153]。这会降低癌细胞上的抗原密度，从而降低它们的杀伤力，但也会导致CD19+ T细胞的杀伤和衰竭。这一发现决定了组合靶向CAR T细胞策略的基本原理。
人源化小鼠有助于评估针对多种癌症的各种癌症抗原的 CAR T和 NK细胞疗法的安全性、有效性和特异性。更重要的是，他们经常提供创新策略的概念证明以克服当前CAR T 细胞的局限性与其转化为临床之间缺失的联系。
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